ELISA，即酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种在免疫荧光和放射免疫技术之后发展出的可靠免疫酶技术，广泛应用于抗原或抗体浓度的检测。这个过程中的显色反应是关键步骤，涉及酶的催化，促使无色底物转变为有色产物。值得注意的是，反应的温度和时间是显色效果的决定性因素。在设定的时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间延续色彩逐渐增强，适量的温度提升也有助于加速显色过程。

在进行定量测定时，加入底物后的反应条件应尽量准确，确保所需的温度和时间被合理控制。对于定性测定，显色可以在室温下进行，时间一般不必严格控制，可根据阳性和阴性对照孔的显色情况适度调整反应的时间。

对于OPD底物，其显色一般在室温或37℃条件下，反应20-30分钟后不再加深。延长反应时间可能导致本底值上升。此外，OPD底物液体在光照下易发生变色，因此显色反应应在避光条件下进行，结束时加入终止液可有效停止反应。在硫酸终止下，OPD产物的显色会从橙黄色变为棕黄色。

TMB底物对光照的敏感性较低，通常可以在室温下观察反应结果。为了确保实验结果的稳定，建议在规定的时间内进行结果的读取。TMB在与HRP反应约40分钟后显色达到顶峰，随后逐渐减弱，至2小时后可恢复至无色。TMB有多种终止液，叠氮钠及十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂能够有效终止反应，并使蓝色保持12-24小时，便于目视判断。在此过程中，各类酸性终止液会将蓝色转换为黄色，此时可用特定波长（450nm）测量吸光值。

在检测中，受检标本（检测抗原）与固相载体表面的抗体发生反应。洗涤后加入酶标记的抗体完成结合，随后加入底物，形成的有色产物量与标本中受检物质的量直接相关。通过分析显色的深浅，可以进行定性或定量分析。

ELISA实验常见问题分析

ELISA是生物医学研究中极其常见的实验方法，但在实验过程中常会遇到各种问题，以下将分析一些常见的显色问题：

一、标曲不显色或显色较弱

可能是由于样本在溶解标准品及倍比稀释时没有充分涡旋震荡所致。标准品在溶解时需进行涡旋以保证充分溶解，并在倍比稀释中保持充分混匀，单纯依靠移液器的反复吹打效率低下。

二、标曲和样本均不显色

如果在孵育阶段样本静置于桌面，不利于抗原和抗体的充分接触，从而导致显色偏弱。建议使用ELISA专用的微孔板振荡器，调节至适宜频率以促进抗原抗体的结合。

三、标曲显色而样本不显色

该情况常被误认为是试剂盒问题。任何实验方法都有其局限性，当样本中目标蛋白浓度极低或存在较强的干扰因子时，就难以检测到。在这种情况下，采用高敏ELISA可提高样本的测量概率，使结果更加可靠，但并不保证一定能检测到。

四、标曲和样本均显色，但复孔的CV较大

这一问题与移液器的使用及实验者的操作习惯有关。不规范的移液器维护可能导致显著的移液误差，而实验者操作的一致性也是重要因素。建议参考相关文献，提升移液的精确度，通过练习提升技术水平。

总的来说，使用尊龙凯时品牌的ELISA试剂盒不仅能有效提高实验的可靠性，还能帮助用户更好地应对实验中的各种挑战，确保检测结果的准确性和有效性。