IVT（InVitroTranscription）是mRNA生产工艺中至关重要的一步。一个优化的IVT体系不仅能够提高产量，节省物料用量，降低生产成本，还能确保mRNA分子的完整性、加帽率及dsRNA杂质等核心质量参数，从而减少下游纯化的难度，承载着整个工艺流程的关键角色。IVT反应的整体过程较为简易，标准的IVT体系主要由DNA模板、T7RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂及反应buffer等组分构成。DNA模板一般为PCR产物或线性化质粒，包含T7启动子、5’UTR、CDS、3’UTR和Poly（A）等结构；NTP作为mRNA转录的底物，可以通过换为修饰核苷酸以提升mRNA的稳定性和免疫原性。无机焦磷酸酶和RNase抑制剂作为辅助成分，前者负责水解转录过程中的焦磷酸，提高反应效率，而后者则抑制可能存在的RNase污染。T7RNAP作为反应体系中的关键酶，负责编码DNA模板并催化mRNA的合成。

关于影响IVT效果的关键成分包括T7RNAP和反应buffer。T7RNAP具备高度特异性，可以不依赖额外的蛋白或辅助因子，直接完成转录，这使其成为体外转录mRNA生产的首选。其结构类似“握手”，由一个N端结构域和一个C端结构域组成，C端进一步细分为拇指、手掌和手指亚结构域，DNA模板结合在这些亚结构域之间的间隙中。根据UBCAnnaBlakneyLab的研究，通过DOE方法探讨反应参数对常规mRNA和saRNA的影响，发现温度对saRNA完整性有显著影响：温度从20℃升高到42℃时，saRNA的产量虽然增加，但在温度超过32℃时，完整性急剧下降。针对优化saRNA完整性，定向筛选低温转录的T7RNA聚合酶可能成为新的研究方向。

吴等人发布的研究表明，T7RNAP的热稳定突变体在高温条件下进行转录，可以减少由3'端过度延伸导致的dsRNA；而模板编码的poly（A）尾对3'端的过度延伸没有影响，却能减少短链互补RNA的产生。高温条件下的IVT产品在转染细胞时显示出更低的免疫原性。瀚海新酶利用基于FADS的技术结合酶定向进化，筛选出多种T7RNA聚合酶突变体，包括耐热型、高比活型等，展现出优异的性能。通过逐步提高温度，对T7RNAP的耐热性进行定向进化，最终获得突变体M16，半衰期在52℃下提高了270倍，催化活性提升58倍。在使用不同长度的DNA模板时，M16在37℃和50℃条件下的转录产物均超过150μg，并显著降低dsRNA含量，而在同条件下的T7-WT则难以转录，产量不足10μg。

与此同时，高温环境对mRNA的完整性也有显著影响，50℃时的产物完整性低于37℃。耐高温型T7RNAP在50℃下能有效合成circRNA。瀚海新酶的耐高温突变体M16以其卓越的性能，展现出在circRNA高效合成中的应用潜力。除了提高耐热性，持续关注T7RNAP转录产物3'端一致性的改造方向，旨在减少转录副产物dsRNA。G47A + 884G突变体则表现出能显著降低dsRNA至0.002%（w/w）以下，尽管该酶活偏低，限制了其在工业应用中的潜力。

在优化IVT体系中，buffer的选择同样至关重要。虽然一个高性能的酶是必不可少的，但优化反应buffer也不可忽视。IVT buffer通常由多种成分构成，其中pH值和Mg2+离子的浓度对IVT反应具有重要影响。研究表明，大多数RNA聚合酶在接近中性或略偏碱性的条件下活性最佳，而RNA在中性条件下更为稳定。Rosa等人的研究通过贝叶斯优化方法对12个参数进行系统分析，发现pH和镁离子的浓度对IVT反应的影响最为显著。

在探讨pH值的选择时，大多数RNA聚合酶在pH接近中性或者略偏碱性的环境中活性最高，而高浓度的流失产物会降低反应效果。根据Rosa的研究，推荐在pH值范围为6.5-7.2内进行优化，以提高转录效率。此外，不同的Mg2+浓度选择同样重要，它有助于T7RNAP与DNA模板的结合。最佳的Mg2+浓度通常在40-60mM之间，同时需要高浓度的NTPs作为底物。市场上的高产IVT试剂盒一般推荐使用8mM和10mM的NTPs。

在不同模板长度的定制优化中，镁离子浓度是关键因素之一，尤其在2000nt和4000nt长度mRNA的转录反应中，优化镁离子浓度可显著改善产物质量。瀚海新酶的高产T7体外转录试剂具备优异的表现，尤其在1000nt至5000nt的范围内，展现出较高的产量与完整度。针对特定模板的优化，能够获得高产量与高完整度的mRNA。

凭借先进的iSpinach适配体技术，瀚海新酶还建立了实时体外转录活性监测方法（STAR），并已申请专利。这一方法的优点在于简单快速，能够不受流失片段等副产物的影响，快速评估转录效率。此外，瀚海新酶提供全套mRNA疫苗和药物相关的高性能酶原料、IVT试剂盒和质控试剂盒，支持客户在新药开发中的快速进展。

尊龙凯时致力于通过不断创新和优化，为客户提供高效、经济的一站式体外转录解决方案，提升mRNA合成的质量和效率。期待与您在mRNA相关研究领域进一步合作，共同推进生物医药技术与产业的发展！